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質(zhì)粒提取的原理與常見問題
發(fā)布者：莊盟生物發(fā)布時(shí)間：2015-03-09瀏覽次數(shù)：13366次
質(zhì)粒提取原理及常見問題解析
質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細(xì)胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細(xì)菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。(Vector)(DNA)
目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的0.5%～3%。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對(duì)分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類的相對(duì)分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1～2個(gè)質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒。這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還會(huì)使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。
質(zhì)粒提取原理
現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒（＞15Kb）。
堿裂解法是一種最廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA，染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒為共價(jià)閉合環(huán)狀分子。當(dāng)pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)至中性后即可以恢復(fù)其天然構(gòu)象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA仍在上清中。
質(zhì)粒提取常見問題分析
1、影響質(zhì)粒提取的因素有哪些？
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)菌細(xì)胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。
2、為什么從革蘭氏陽性菌中提取質(zhì)粒要在懸浮液中加入溶菌酶？
革蘭氏陽性菌有一層細(xì)胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。
3、如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇不同級(jí)別的產(chǎn)品？
從純度上：各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉(zhuǎn)化，普通純度的質(zhì)粒可以滿足要求；而對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，則要求使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒方能滿足要求。
從提取的量上：1-20μg，應(yīng)選擇小量提取試劑盒；20-40μg，應(yīng)選擇中量提取試劑盒；大于40μg，應(yīng)選擇大量提取試劑盒。
從宿主菌上：分為普通細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、G+菌質(zhì)粒提取試劑盒和酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒，根據(jù)情況進(jìn)行選擇。
■ 未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低：
△ 大腸桿菌老化
請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
△ 質(zhì)?？截悢?shù)低
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
△ 菌體中無質(zhì)粒
有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。
例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
△ 堿裂解不充分
使用過多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液1、2和3的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)，可加倍使用溶液1、2和3，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。
△ 溶液使用不當(dāng)
溶液2、3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
△ 吸附柱過載
不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長率，則需調(diào)整LB培養(yǎng)液體積。
△ 質(zhì)粒未全部溶解（尤其質(zhì)粒較大時(shí)）
洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。
△ 乙醇?xì)埩?
漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。
△ 洗脫液加入位置不正確
洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。
△ 洗脫液不合適
DNA只在適當(dāng)pH值的低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液TE (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水；洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH 7.0–8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使更用有利于提高洗脫效率。
△ 洗脫體積太小
洗脫體積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
△ 洗脫時(shí)間過短
洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置一分鐘可達(dá)到較好的效果。
■ 質(zhì)粒質(zhì)量不高：
△ 混有蛋白
不要使用過多菌體。溶液1、2、3處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。
△ 混有RNA
RNase A處理不徹底，請(qǐng)減少菌體用量或加入溶液3之后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液1已保存6個(gè)月以上，請(qǐng)?jiān)谌芤?中添加RNase A。
△ 混有基因組DNA
加入溶液2和3后應(yīng)溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液2后過于粘稠，無法溫和混勻，請(qǐng)減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，不要超過16小時(shí)。
△溶液3加入時(shí)間過長
溶液3加入后，放置時(shí)間不要太長，否則有可能會(huì)產(chǎn)生小片段DNA污染。
△ 含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。
△ 裂解時(shí)間過長
加入溶液2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過5分鐘。
△ 質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式
質(zhì)粒復(fù)制過程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出。
